مقاله بررسی خواص نوعی داربست زیست تخریب پذیر پلیاستر یورتانی بر پایه پلیکاپرولاکتون جهت کاربرد در مهندسی بافت

بررسی خواص نوعی داربست زیست تخریب پذیر پلیاستر یورتانی بر پایه

پلیکاپرولاکتون جهت کاربرد در مهندسی بافت

چکیده

کاربرد پلیمرهای زیست تخریب پذیر به عنوان یکی از پیشرفتهای عمده در تحقیقات مواد در پزشکی مطـرح اسـت. بـه عنـوان مثـال در مهندسی بافت از ماتریس ها و داربست های زیست تخریب پذیر پلیمری به عنوان حامل سلول برای بازسـازی بافـت هـای معیـوب اسـتفاده میشود. در این تحقیق، داربستهای متخلخل پلی استر یورتانی زیست تخریب پذیر با سایز تخلخل ۵۰ تا ۲۵۰ میکرومتر به روش ترکیبی شستشوی نمک و freeze-drying تهیه گردید و خواص فیزیکی و مکانیکی آنها به کمک دستگاه پراش پرتو ایکس (XRD)، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و آزمون تست کشش ارزیابی شدند. بررسی خصوصیات مکانیکی نشان دادند که استحکام کششی، درصد ازدیـاد طول تا نقطه شکست و مدول یانگ نمونهها به ترتیب در محدوده ۴/۸ تا ۶/۶ مگا پاسکال، ۶۰ تا ۱۲۰ درصد، ۲۴ تا ۵۶ مگا پاسکال بـود و مدول یانگ و استحکام کششی با افزایش نسبت NCO/OH افزایش مییابند. همچنین آزمون تخریبپذیری نمونهها بصورت دینامیکی در دمای ۳۷-۰/۱œC در محلول بافر فسفات با pH=7/4-0/2 انجام گرفت. زیست سازگاری نمونهها نیز با استفاده از آزمون کشت سلولی رده سلولی L-929 مطالعه شد که حاکی از زیستسازگاری مناسب نمونهها بود.

واژههای کلیدی: پلیاستر یورتان، داربست مهندسی بافت، زیست تخریب پذیری، خواص مکانیکی.

-۱ مقدمه

پلییورتانهـا خـانوادهای از پلیمرهـا هسـتند کـه بـه دلیـل خــواص زیســتســازگاری و مکــانیکی مناســب کاربردهــای بسیاری به عنوان بیومتریال یافتهاند .[۴-۱] از پلییورتانهـا در ســاخت کتترهــا [۵]، پوشــش ضــربانســازهای قلبــی، دریچههای قلبی مصـنوعی [۶]، بطـن کمکـی قلـب ۷]و[۸، مهندسی بافـت ۹]و[۱۰ و سیسـتمهـای نـوین دارو رسـانی [۱۱] بهره برده شده است. مهندسی بافت یکی از جدیدترین روشهای تحقیقاتی مورد استفاده در ترمیم بافتهای آسیب دیده بـدن بـوده کـه در آن بـا اسـتفاده از داربسـت زیسـت تخریــب پــذیر متخلخــل، تــرمیم بافـت صــورت مــیگیـرد ۱۲]و.[۱۳ این داربسـتهـا بـه عنـوان حامـل سـلول بـرای بازسازی بافتهای معیوب بکار برده میشوند و خـواص آنهـا در موفقیت بیومتریال نقش تعیین کنندهای دارد .[۱۳]

انتخــاب مــواد اولیــه و روش تهیــه داربســت پلــییورتــانی، پـذیرخصوصیات زیسـتتخریـب آن ی و زیسـتسـازگاری را تحت تأثیر قرار میدهد ۱]و.[۱۵ دیایزوسیاناتهایی ماننـد هگــزامتیلن دیایزوســیانات و پلــیالهــای اســتری نظیــر پلیکاپرولاکتون دیال از جمله مواد اولیه مـورد اسـتفاده در سنتز پلییورتانها بهشمار میروند .[۱۶] در حقیقت وجـود پیوند استری در سـاختار نهـایی پلـییورتـان، عامـل اصـلی تخریـب پـذیری آن محسـوب مـیشـود .[۱۵] هگـزامتیلن دیایزوسیانات به دلیل طبیعت غیرسمی آن پر مصرفتـرین ایزوســیانات بکــار رفتــه در ســاختار پلــییورتــانهــای زیستتخریب پذیر بوده است .[۱۷] ساختار مولکولی متقارن این ماده موجب برهمکنشهای بین مولکولی قوی با تشکیل پیوندهای هیدروژنی میشود. در نتیجه میتـوان مـوادی بـا استحکام بالا تهیه نمـود .[۱۸] پلـیکـاپرولاکتون، پلیمـری

زیستتخریب پذیر با محصولات تخریب زیستسازگار اسـت و برای تهیه پلیاستر یورتانها در تحقیقات زیـادی اسـتفاده شده است .[۲۳-۱۹]

روشهای زیادی برای تهیـه داربسـتهـای متخلخـل مـورد بررسی قـرار گرفتـه اسـت کـه از جملـه آنهـا مـیتـوان بـه روشهای شسشتویریختـهعامل حفرهزا، گـری بـا حـلال و freeze-drying و . . . اشاره نمود. در تحقیقات جدیـد بـرای دستیابی به ابعاد تخلخل مناسـب و درصـد تخلخـل بـالا، از روشهای ترکیبی نیز بهره گرفته میشود ۲۴]و.[۲۵

در این تحقیق، پلییورتانهای زیسـت تخریـب پـذیر برپایـه پلــیکــاپرولاکتون (PCL)، هگــزامتیلن دی ایزوســیانات (HMDI) و کـــــــوپلیمری از ۱و-۴ بوتـــــــان دی ال BD/HMDI/(BD) به روش ترکیبی شستشـوی نمـک و freeze-drying تهیه شـد و خـواص فیزیکـی و مکـانیکی آنها بررسی گردید.

دمای ۸۰œC به مدت ۳۰ دقیقه با همزن مکانیکی و تحـت اتمسفر نیتروژن انجام شد. در انتها مقدار اضـافی بوتـان دی ال بوسیله استون خشک شستشو و خارج شد.

پلیکاپرولاکتون درون راکتـور در دمـای ۸۰œC ذوب شـد و هگزامتیلن دی ایزوسیانات با نسبت های مولی NCO/OH به ترتیب ۲/۱، ۴/۱ و ۶/۱ بهصورت قطره قطره به آن اضـافه گردید. این واکنش به مدت ۴ ساعت تحت اتمسفر نیتـروژن ادامه یافت تا پیشپلیمر بدست آید (جدول .(۱

در نهایت زنجیر افزاینده که یک جامد سفید رنگ بـود در دی متیل سولفوکساید (DMSO) بـا نسـبت وزنـی w/w 50% حل شد و به پیشپلیمر اضافه گردید. این واکنش نیز به مدت ۳۰ دقیقه ادامه پیدا کرد. در انتها نمونـه از راکتـور خارج گردید و با آب شستشو داده شد. پس از آن در دمـای ۴۰œC در آون خلاء با فشار ۲۰mbar قرار گرفت تـا بطـور کامل خشک شود.

-۲ مواد و روشها

-۱-۲ مواد اولیه

پلـیکــاپرولاکتون دیال (PCL) از شـرکت Aldrich بــا وزن مولکولی ۲۰۰۰gr/mol و ۱و-۴بوتان دیال (BD) بـا وزن مولکــولی ۹۰/۱۸ gr/mol محصــول شــرکت Merck بودند که قبل از استفاده در آون خلاء تحت فشـار ۵ mbar و در دما ۱۰۰œ C به مدت ۲۴ ساعت آبگیری شـدند. هگـزا متیلن دی ایزوسـیانات (HMDI) و حـلالهـای دیمتیـل سولفوکســـاید (DMSO) و ۱و -۴دی اکســـان محصـــول شرکت Merck بودند و به همان صورت اولیه مورد استفاده قـرار گرفتنـد. بــرای ایجـاد تخلخـل از ذرات نمــک NaCl شرکت Merck استفاده شد و به کمک الـکهـای مناسـب اندازه ذرات بین ۱۵۰ تا ۳۰۰ میکرومتر جدا گردید.

-۲-۲ روش سنتز

برای سنتز پلییورتانها از یک راکتور چهاردهنـه شیشـهای همراه با همزن مکانیکی (۴۰۰rpm) استفاده شد. ابتدا زنجیر افزاینده از واکـنش ۱و-۴ بوتـان دی ال و هگـزا متـیلن دی ایزوسیانات با نسبت مولی ۶ به ۱ تهیه گردیـد. واکـنش در

جدول :۱ نسبتهای NCO/OH در نمونهها

-۳-۲ ایجادتخلخل در نمونهها

براساس تحقیقات انجام گرفته در مـورد روشهـای سـاخت داربســتهــای پلــییورتــانی، یکــی از مناســبتــرین و اقتصادیترین روشها، استفاده از نمک برای ایجـاد تخلخـل است .(Particulate Leaching) سادگی و سهولت ایـن روش و عدم نیاز به تجهیزات پیچیده در فرآیند ساخت و همچنین استفاده از عوامل غیر سمی (NaCl) برای ایجـاد تخلخـل در داربست به جای ورود ترکیبات سمی در محصـول نهـایی، از جمله مزایای آن بهشمار میرود. ضمن اینکه، نمک باقیمانده با آب مقطر شسته میشود.

جهت ایجاد تخلخل در ساختار، ابتدا نمونههای سـنتز شـده در ۱ و ۴ دیاکسان با غلظت ۲۰%w/w حل شد. سپس بـه ازای هرگرم پلیمـر، ۲/۵ گـرم ذرات NaCl بـا انـدازه مـش

۳۰۰- ۱۵۰ میکرومتر به محلول اضافه شـد. پـس از آن بـه میزان %۴ وزن کل مخلوط، آب مقطر اضافه گردید. در ادامه به سرعت محلول تا دمای -۱۵ °C سرد شد و سپس تحـت عملیات freeze-drying (دستگاه Christ Alpha 1-2 LD محصول کشور آلمان) قرار گرفت.

برای خارج شدن و حل شدن ذرات نمک، نمونهها بـه مـدت ۱۲ ساعت در آب مقطر قرار گرفتند تا با حـذف ذرات نمـک ساختار متخلخل نهایی حاصل شود.

-۴-۲ روشهای شناسایی و ارزیابی

طیف FT-IR بهوسـیله دسـتگاه BOMEM مـدل MB100-SERIES ساخت کشور کانادا گرفته شـد. از دسـتگاه پـرس GRASEBY SPECAC ساخت کشور کانادا جهـت فشـرده آمادهسازی نمونهها و سازی آنها برای آزمون کشش استفاده گردیــد. دســتگاه SEM مــدل LEO 440I ســاخت کشــور انگلیس برای بررسی مورفولوژی تخلخلها مورد استفاده قرار گرفـت. پوشـشدهـی تحـت جریـان ۱۸mA و فشـار خـلاء ۲mbar انجام گرفت. دستگاه تست خواص مکانیکی در ایـن آزمـایش INSTRON 1195 سـاخت کشـور انگلسـتان بـود، سرعت کشش نمونهها برابر ۱mm/min و طول نمونه بین دو فک برابر ۱۸mm تنظـیم شـد. همچنـین از دسـتگاه XRD مدل ۳۰۰۳ PTS، با سیستم اسکن مرحلـهای بـرای گـرفتن
طیف XRD بهره برده شد.

جهت ارزیابی سمیت سلولی و زیستسازگاری، ابتدا تمـامی موارداملاًک شستشو داده شدند و سـپس توسـط اتـوکلاو در دمای ۱۲۱°C برای مدت ۲۰ دقیقه اسـتریل شـدند. پـس از آن به ترتیب مراحل زیر جهت آزمایش کشت سـلولی انجـام شد. سلولهای مورد استفاده سـلول فیبروبلاسـت دم مـوش L929 بودند. پس از قرارگیری نمونهها درون پلیت کشت، به هر خانه مقدار ۲ml محیط کشت سرم و سلول اضافه شـد و سپس پلیت کشـت درون انکوبـاتور CO2 و در دمـای ۳۷°C قرار گرفت. پس از گذشت یک هفته از زمان کشت، نمونهها مورد ارزیابی و بررسی قرار گرفتند.

-۳ بحث و نتیجه گیری

-۱-۳ بررسی نتایج خواص مکانیکی

در جدول ۲ نتایج حاصل از تست کشش نمونهها آورده شده است. نمونه PUA1 نسبت به نمونههای دیگر دارای درصـد ازدیاد طول بیشتری بوده و نمونه PUA3 بیشـترین مقـدار استحکام کششی و مدول یانگ را دارا است. این نتایچ نشـان میدهد که با افـزایش درصـد NCO در ترکیـب پلـیاسـتر یورتان، استحکام کششی افزایش یافته و درصد تغییـر طـول تا نقطه شکست کاهش مییابد.

-۲-۳ بررسی طیف XRD نمونهها

طیف XRD بیانگر میزان بلـورینگی نمونـههـای نمونـههـای پلییورتان سنتز شده است. طیفهـای بدسـت آمـده نشـان میدهند که نمونـههـا دارای بخـشهـای بلـورین و آمـورف هستند. همچنین مشاهده مـیشـود کـه ذرات نمـککـاملاً شسته نشده و در داربست باقی مانده است.

با مقایسه طیف XRD نمونـههـا مشـاهده مـیشـود کـه بـا افـزایش دیایزوسـیانات در ترکیـب پلـییورتـانهـا، درصـد بلورینگی افزایش مییابد. ایـن امـر ناشـی از وجـود سـاختار متقارن هگزامتیلن دیایزوسیانات است که افزایش آن باعث افزایش بلورینگی پلیمر میگردد.

شکل :۱ طیف XRD نمونهها

-۳-۳ بررسی نرخ تخریبپذیری in vitro

تخریب پذیری نمونههای پلییورتانی در دمای ۳۷-۰/۱œC به مدت ۱۸ هفته بررسی شد. برای این کـار از محلـول بـافر فسفات با pH=7/4-0/2 استفاده گردید که بـه ازای هرگـرم پلـی از نمونههـای یورتـانی ۳/۵ ml از محلـول بـافر فسـفات اختصاص داده شد. این آزمایش بـهصـورت دینامیـک انجـام

گرفت و طی آن در هر ۲ هفته محلول بافر فسـفات تعـویض شد. پس از بازههای زمانی ۲ هفته، نمونههـا از محلـول بـافر فسفات خارج شدند و بـه مـدت ۱ سـاعت در آون خـلاء بـا دمای ۵۰°C و فشار ۱۵mbar قـرار گرفتنـد. سـپس تـوزین شدند و کاهش وزن نمونهها ثبت گردید. پیچیدگی ساختار، مورفولوژی و درصد بلورینگی پلیمـر در تخریـب پـذیری آن نقش مهمی دارد .[۱۸] این آزمایش نشان داد که با افـزایش نسـبت NCO/OH در پلیمـر، پیونـدهای عرضـی و سـاختار شبکهای بیشتر شده و نفوذ آب و مایعات بـه درون سـاختار پلیمر کاهش مییابد. نمودار ۱ روند تخریب نمونهها را طـی ۱۸ هفته نشان میدهد.

نمودار :۱ نمودار کاهش وزن نمونه ها برحسب مدت زمان

قرارگیری (هفته) در محلول بافر فسفات

-۴-۳ بررسی ساختار تخلخلباها SEM

در مهندسی بافت تخلخلهای داربست یکـی از پارامترهـای مهم و اساسی محسوب میشـود. انـدازه و نظـم تخلخـلهـا، اتصال و بهم پیوستگی تخلخـلهـا، چسـبندگی سـلولهـا و توانائی نفوذ سلولهـا بـه داخـل داربسـت در موفقیـت یـک داربست مهندسی بافت اهمیت زیادی دارنـد. تخلخـلهـا از یک طرف موجب کاهش استحکام مکانیکی داربست شـده و از طرف دیگر برای آنکه سلولها بتوانند درون این تخلخلها نفوذ و رشد کنند، داربسـت بایـد دارای سـایز تخلخـلهـای مناسبی باشد. به عنوان مثـال در مهندسـی بافـت غضـروف تخلخلهای با ابعاد ۵۰ تا ۱۵۰ میکرومتر برای رشد سلولها مناسب هستند. سلولها در تخلخلهای بسیار ریز نمیتوانند

Facebook Twitter Google+ LinkedIn Pinterest Print